Βελτιστοποίηση βολικών μηχανών PCR σε πραγματικό χρόνο

Εάν πρόκειται για ποσοτική PCR φθορισμού σε πραγματικό χρόνο για ποσοτικοποίηση ιού και γονότυπη SNP, χρειαζόμαστε μια μηχανή PCR με την υψηλότερη δυνατή εξειδίκευση. Εάν πρόκειται για ανίχνευση παθογόνου και mRNA, χρειαζόμαστε μηχανή PCR υψηλής ευαισθησίας , έτσι πώς πρέπει να βελτιστοποιήσουμε αυτό το μηχάνημα PCR;

Εδώ είναι η λίστα περιεχομένου:

l Βελτίωση της απόδοσης ενίσχυσης της μηχανής PCR

l Χρησιμοποιώντας εκκινητές μηχανής PCR σε πραγματικό χρόνο για γενική PCR

Βελτίωση της απόδοσης ενίσχυσης της μηχανής PCR

Για να βελτιώσουμε την απόδοση, την εξειδίκευση και την ευαισθησία της μηχανής PCR , μπορούμε να βελτιστοποιήσουμε την ποσοτική μηχανή PCR σε πραγματικό χρόνο για το πείραμα μέσω μιας σειράς μέτρων. Η πρώτη είναι η επιλογή της ακολουθίας προορισμού.

1, η επιλογή της βολικής αλληλουχίας στόχου PCR σε πραγματικό χρόνο, κατάλληλο μήκος μεταξύ 50 και 150bp. Οι βραχύτερες αλληλουχίες χρειάζονται λιγότερο χρόνο για να συνθέσουν και να έχουν μικρότερους χρόνους ενίσχυσης, οπότε η πιθανότητα να ενισχυθεί η μόλυνση του DNA μειώνεται.

2, κατά την επιλογή της ακολουθίας προορισμού, χρησιμοποιήστε την αναζήτηση έκρηξης για να αναλύσετε την ακολουθία προορισμού για πολυμορφισμούς και σφάλματα αλληλουχίας και να τα αποφύγετε. Εάν υπάρχουν διπλές ακολουθίες στην ακολουθία προορισμού, θα μειώσει την ευαισθησία ανίχνευσης αυτής της μηχανής PCR και θα πρέπει επίσης να αποφευχθεί.

3, ελέγξτε το περιεχόμενο GC ≤ 60% στην ακολουθία προορισμού. Η υψηλή περιεκτικότητα σε GC, θα επηρεάσει τη μετουσίωση της αλληλουχίας στόχου στον θερμικό κύκλο, αλλά και εύκολο να παραχθεί αυτή η μη ειδική ενίσχυση της μηχανής PCR.

4, αποφύγετε τη δημιουργία δευτερογενούς δομής. Οι αλληλουχίες στόχων με αντίστροφες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες είναι εύκολο να παραχθούν δευτερεύουσα δομή, η οποία επηρεάζει την υβριδοποίηση των βολικών εκκινητών και ανιχνευτών μηχανής PCR σε πραγματικό χρόνο.

Εκτός από αυτό, πρέπει επίσης να διασφαλίσουμε ότι η ποιότητα του προτύπου δεν θα επηρεάσει την ενίσχυση, τα αποτελέσματα της βολικής μηχανής PCR σε πραγματικό χρόνο έχουν αξιοπιστία. Για παράδειγμα, το κατεστραμμένο DNA δεν μπορεί να ενισχυθεί επαρκώς στη μηχανή PCR ή να μην ενισχυθεί καθόλου. Επίσης, η παρουσία αντιδραστηρίων αναστολής πολυμεράσης ϋΝΑ (DMSO, κλπ.) Και μολυσματικών ουσιών (SDS κ.λπ.) στο πρότυπο μπορεί να επηρεάσει την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων ενίσχυσης της μηχανής PCR.

Χρήση εκκινητών μηχανής PCR σε πραγματικό χρόνο για γενική PCR

Αποκτήστε βολικούς εκκινητές σε πραγματικό χρόνο μηχανής PCR , αυτή η μέθοδος μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για συνηθισμένη PCR.

1, το μήκος πρέπει να είναι 18-30bp για να εξασφαλιστεί η εξειδίκευση της δέσμευσης.

2, η θερμοκρασία τήξης (τιμή TM) πρέπει να είναι 55-60 ° C και οι τιμές TM των δύο εκκινητών θα πρέπει να διαφέρουν κατά 2-3 ° C.

3, κάθε εκκινητής θα πρέπει να έχει 1 έως 3 γουανίνες ή κυτοσίνες στο 3 'άκρο, γεγονός που μπορεί να μειώσει βολικά τη μη ειδική ενίσχυση κατά τη διάρκεια της μηχανής PCR σε πραγματικό χρόνο. Περισσότεροι από 3 θα αντιστραφούν και θα προκαλέσουν ένα 'συρόμενο αποτέλεσμα ' που θα οδηγήσει σε λάθος επέκταση.

4. Το περιεχόμενο GC των εκκινητών πρέπει να είναι περίπου 50%, πολύ υψηλό περιεχόμενο GC θα αυξήσει την τιμή TM.

5, οι εκκινητές μηχανής PCR θα πρέπει να αποφεύγουν αντίστροφες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, επειδή θα σχηματίσουν μια δευτερεύουσα δομή, επηρεάζοντας τη δέσμευση του εκκινητή στο πρότυπο.

6, εάν είναι RT-PCR, πρέπει επίσης να αποφύγετε το σχεδιασμό των εκκινητών για να δεσμεύσετε τις αλληλουχίες εξονίου, οι οποίες θα οδηγήσουν σε ψευδώς θετικά πειραματικά αποτελέσματα της μηχανής PCR. Η σωστή προσέγγιση θα πρέπει να σχεδιάζεται στη μακρά πλευρά του ιντρονίου ή σε μικρά ιντρόνια ή σε ολόκληρη την περιοχή διασταύρωσης εξονίου.

7.

Σημειώστε ότι μερικές φορές, όταν έχετε κάνει όλα τα σημεία, οι εκκινητές μπορεί να μην ενισχύσουν, οπότε πρέπει να επανασχεδιάσετε τους εκκινητές.

Εστιάζοντας στην ταχεία ανίχνευση νουκλεϊνικού οξέος και την ταχεία ανίχνευση POCT, Bioteke προσφέρει είδη εργαστηριακών οργάνων ως: συλλογή δειγματοληψίας ιού, αυτόματο εξολίτη νουκλεϊνικού οξέος, μηχανή PCR και συσκευή απολύμανσης. Και παρέχει επίσης πολλά είδη αντιδραστηρίων και κιτ.